摘要:感染､休克､心脏大手术以及肾移植过程中肾脏均会遭遇缺血再灌注(ischemia/reperfusion,IR)的情况,造成急性肾脏损伤(acutekidneyinjury,AKI)｡而部分AKI患者会进展为慢性肾脏病(chronickidneydisease,CKD),甚至会发展为终末期肾功能衰竭(endstagerenaldisease,ESRD),极大影响患者的生存质量和生活质量｡IR引起肾脏损伤的病理生理机制复杂,涉及到体内多个系统､多种因素､多个通路的共同作用,而现有预防和治疗IR引发急慢性肾损伤的药物和方案并未达到理想的效果｡重组人ADAMTS13(recombinanthumanadisintegrinandmetalloproteasewiththrombospondinmotifs13,rhADAMTS13)可用于血栓性血小板减少性紫癜患者的治疗,减轻患者急性肾功能损伤｡因此,rhADAMTS13可否用于其他原因引发肾脏病的治疗引起我们的注意｡既往临床研究证实血管性血友病因子(vonWillebrandfactor,VWF)/ADAMTS13比例增高及ADAMTS13的活性降低与肾功能的下降密切相关｡动物实验提示ADAMTS13除具有抗微血管血栓形成用于延缓糖尿病肾病的治疗外,也具有抗炎的作用,可用于治疗缺血性脑损伤和心肌缺血再灌注损伤｡因此该实验建立IR引发急慢性肾损伤的动物模型,观察肾脏AKI及CKD时期VWF和ADAMTS13的表达;且以rhADAMTS13外源性给药的方式,观察rhADAMTS13对IR引发急慢性肾损伤的作用,并且进一步探讨该药物发挥作用的机制,为该药物可否作为临床AKI及CKD患者的治疗性用药,及其可否用于治疗类似机制的其他疾提供一定的实验基础｡第一部分:肾脏缺血再灌注不同阶段VWF/ADAMTS13的表达及其与氧化应激水平的相关性研究目的:构建IR小鼠模型,探究再灌注后不同时间点VWF､ADAMTS13表达的改变｡并且进一步分析VWF､ADAMTS13的表达与机体氧化应激和炎症因子的相关性｡方法:1)双侧肾脏缺血后恢复灌注建立IR模型｡复灌后不同时间点收集小鼠血液､尿液及肾组织｡2)检测小鼠肾功能､氧化应激及炎症反应相关指标和24小时尿液中蛋白及ADMATS13含量｡3)检测小鼠血浆VWF､ADAMTS13水平及肾组织VWF及ADAMTS13mRNA表达｡结果:1)缺血20分钟,复灌24小时及48小时后血清肌酐(serumcreatinine,Scr)､尿素氮(bloodureanitrogen,BUN)和24小时尿蛋白较sham组显著增加｡缺血18分钟恢复灌注术后3月后BUN和Scr较sham组增加｡IR后不同时间点小鼠血浆VWF水平增高,ADAMTS13下降,VWF:ADAMTS13比值增加,尿ADAMTS13流失增加｡2)IR后不同时间点小鼠丙二醛(malonaldehyde,MDA)水平增加,血浆肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF-α)和白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)水平增加,超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性下降,尿过氧化氢(hydrogenperoxide,H2O2)增多｡3)血浆VWF:ADAMTS13比值与MDA,TNF-α呈正相关,与SOD､CAT活性呈负相关｡血浆VWF:ADAMTS13比值与尿蛋白含量显著呈正相关｡结论:该研究表明,IR可诱导AKI和CKD｡IR后不同阶段血浆VWF:ADAMTS13比值增高且伴随氧化应激､炎症反应的激活｡VWF:ADAMTS13比值与氧化应激､TNF-α及尿蛋白水平成正相关,与抗氧化应激酶类活性呈负相关｡第二部分:rhADAMTS13对缺血再灌注引发急性肾损伤的保护性作用及机制研究目的:探讨外源性给予人源重组ADAMTS13(RecombinanthumanADAMTS13,rhADAMTS13),是否可减轻IR引发AKI及其保护性作用的机制｡方法:1)双侧肾脏缺血20分钟,构建AKI模型｡术前半小时给予不同剂量rhADAMTS13或者术后半小时给予rhADAMTS13(2.6μg/kg)尾静脉给药｡复灌24小时､48小时后收集小鼠血液､组织标本检测相关指标｡2)试剂盒检测血清BUN､Scr,ELISA检测肾损伤因子(kidneyinjurymolecule-1,KIM-1),胱抑素C(cystatinC,CysC),中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutropilgelatinase-associatedlipocalin,NGAL)及RT-qPCR检测肾组织KIM-1,NGALmRNA表达｡3)PAS染色及免疫组化检测小鼠肾组织病理损伤的程度及凋亡小管上皮细胞的数量｡4)检测氧化应激相关分子｡术前给IR小鼠超氧化物歧化酶类似物(4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidinoxyl,tempol)50mg/kg腹腔注射作为阳性对照组进一步确定ADAMTS13的保护性作用,观察tempol是否可减轻IR诱导AKI｡术后同时给予IR小鼠rhADAMTS13(2.6μg/kg)和VWF(80μg/kg),检测小鼠氧化应激及肾功能相关指标｡探究rhADAMTS13在AKI中的保护性作用是否依赖于VWF｡5)检测小鼠炎症反应相关指标,探究rhADAMTS13是否具有抑制IR小鼠炎症反应的作用及其分子机制｡IR小鼠术前腹腔注射过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PeroxisomeProliferator-ActivatedReceptorγ,PPARγ)抑制剂GW9662(2mg/kg)验证细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,ERK)/PPARγ通路是否参与rhADAMT13对AKI的保护性作用｡6)采用在体静脉给予乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)或者硝普钠(sodiumnitroprusside,SNP)观察血压改变趋势及体外显微微灌注技术比较小鼠肾小球入球动脉对ACh/SNP的血管反应性评价微血管内皮功能｡建立入球小动脉体外缺氧复氧模型(hypoxia/reoxygenation,H/R),孵育rhADAMTS13(3750pg/ml)30分钟,后检测入球小动脉对ACh/SNP的血管反应性评价微血管内皮功能｡7)采用荧光探针法检测显微微灌注的小鼠肾小球入球动脉中荧光信号,评估入球小动脉一氧化氮(nitricoxide,NO)和活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)的表达｡分别采用内皮型一氧化氮合酶抑制剂(NG-Nitro-L-arginineMethylEster,Hydrochloride,L-NAME),tempol和H2O2预孵育体外灌注的入球小动脉,后观察血管对于ACh诱导舒张的反应｡8)Westernblot检测小鼠肾组织Akt/内皮型一氧化氮合酶(Endothelialnitricoxidesynthase,eNOS)磷酸化激活的水平｡rhADAMTS13治疗IR小鼠同时尾静脉注射Akt通路抑制剂Wortmannin(50nmol/kg),检测肾结构和功能改变及血管内皮功能,探究rhADAMTS13对血管内皮功能的改善是否依赖于Akt/eNOS通路｡结果:1)rhADAMTS13治疗可抑制IR小鼠肾组织VWF表达增多､ADAMTS13表达下降,改善肾组织ADAMTS13异常分布｡2)rhADAMTS13降低IR小鼠BUN､Scr及尿蛋白水平的增加,抑制小管上皮细胞的坏死和凋亡｡同氧自由基清除剂tempol—样可保护肾脏减少IR诱导AKI｡3)rhADAMTS13上调核因子E2相关因子(Nuclearfactor-erythroid-2-relatedfactor2,Nrf2)/血红素氧合酶-1(Hemeoxygenase-1,HO-1)水平,增加IR小鼠抗氧化应激酶类的活性,抑制ROS和MDA的产生｡4)rhADAMTS13抑制IR小鼠p38/ERK/环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)/前列腺素E2(ProstaglandinE2,PGE2)的激活,上调PPARγ的表达,抑制IR引起炎症因子的增多和炎性细胞的浸润｡rhADAMTS13治疗IR小鼠同时给予GW9662,与仅给rhADAMTS13治疗IR小鼠相比,GW9662会升高小鼠血清BUN､Scr的水平,加重小管损伤,损伤入球小动脉对ACh诱导血管舒张反应｡5)监测血压同时静脉给予ACh/SNP,结果显示四组小鼠基础血压无明显差异｡但IR小鼠给予ACh,血压下降幅度较sham组减小,而rhADAMTS13可改善这一现象｡四组小鼠SNP引起血压下降的幅度无明显差异｡rhADAMTS13抑制IR引起的入球小动脉ROS的增多,抑制氧化应激相关的内皮依赖性的血管舒张功能障碍｡同时rhADAMTS13可抑制IR引起的Akt/eNOS通路的下调,Akt通路的抑制剂Wortmannin可引起rhADAMTS13治疗IR小鼠BUN,Scr水平的升高,抑制ACh诱导的入球小动脉舒张反应｡6)rhADAMTS13小鼠同时给予VWF,检测结果显示同时接受VWF､rhADAMTS13尾静脉注射的IR组小鼠BUN,Scr较rhADAMTS13治疗组显著升高,MDA及H202表达显著增加,SOD及CAT活性明显下降,入球小动脉对ACh反应明显减弱｡结论:rhADAMTS13可通过剪切VWF,抑制IR引起的氧化应激,继而抑制炎症反应､小管上皮细胞的凋亡､坏死和微血管内皮细胞功能损伤,对缺血再灌注引起的急性肾损伤发挥保护性作用｡第三部分:rhADAMTS13对缺血再灌注引发慢性肾损伤的保护性作用及机制研究目的:探讨rhADAMTS13对缺血再灌注引发慢性肾损伤的保护性作用及该作用的机制｡方法:1)C57BL/6小鼠缺血18分钟后恢复灌注｡术后连续3天,每天一次给予rhADAMTS13(2.6μg/kg)尾静脉给药｡复灌后1周､1月､3月收集小鼠血液､尿液､组织标本检测相关指标｡2)试剂盒检测血清BUN､Scr,24小时尿蛋白量,ELISA检测KIM-1,及RT-qPCR检测肾组织KIM-1,NGALmRNA水平评估肾功能损坏程度｡3)PAS､MASSON､天狼猩红染色评价肾小管损伤程度､肾小球硬化比例和间质纤维化程度｡4)免疫组化染色评价小管上皮间质转化的严重程度及巨噬细胞浸润｡5)检测氧化应激及炎性因子,促纤维化因子在肾组织表达量｡6)荧光探针检测入球小动脉ROS的产生｡入球小动脉体外灌注,给予血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,Ang)和ACh的梯度给药,观察血管收缩舒张功能｡结果:1)术后1周,与sham组小鼠相比,IR小鼠受损肾小管并未完全修复,肾组织KIM-1及NGALmRNA表达增高｡rhADAMTS13治疗IR小鼠较安慰剂给药IR小鼠明显好转｡rhADAMTS13治疗IR小鼠尿中H202较IR组减少｡2)术后1月,IR小鼠尿蛋白增加,间质小管纤维化,KIM-1､NGAL的表达及尿中H202较sham组升高,rhADAMTS13抑制IR小鼠这些指标的增加｡四组小鼠血压及硬化小球比例无统计学差异｡3)术后3月,IR小鼠BUN､Scr水平轻度增高,尿蛋白增加,KIM-1及NGAL水平较高｡肾脏病理表明IR组小鼠硬化肾小球比例和间质纤维化所占的比例增加｡此外,IR组小鼠MDA及H202的增加,Nrf2表达下调,SOD､CAT活性下降,同时伴随炎性因子表达的增加和肾脏巨噬细胞的浸润｡rhADAMTS13可上调IR小鼠Nrf2/HO-1,SOD2及CAT的表达,增加其抗氧化应激能力,抑制肾脏氧化应激,炎症反应,及转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β)TGF-β/Smad3信号通路的激活,进而抑制肾间质纤维化和肾小球硬化｡4)术后3月,IR组小鼠入球小动脉ROS产生增多｡入球小动脉对AngⅡ诱导的血管收缩增强,而对ACh诱导的血管舒张反应减弱｡rhADAMTS13治疗可抑制IR小鼠入球小动脉ROS的产生,改善血管收缩舒张功能障碍｡结论:rhADAMTS13可通过上调机体的抗氧化应激相关基因的表达,抑制氧化应激､炎症因子的产生,改善血管的收缩和舒张功能,进而改善IR引起的CKD,抑制纤维化生成和肾小球硬化｡

关键词:ADAMTS13;VWF;缺血再灌注;氧化应激;急慢性肾损伤;rhADAMTS13;急性肾损伤;炎症;慢性肾脏病;

小鼠VWF免疫分析ELISA试剂盒､小鼠ADAMTS13免疫分析ELISA试剂盒

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