目的:探讨富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(Lgr5)蛋白激活DC(树突细胞)成熟,并诱导产生CD8~+CTL(细胞毒T淋巴细胞),进行结肠癌免疫治疗并探讨其治疗效果,为结直肠癌免疫治疗的临床应用探寻新的治疗靶点。方法:使用Lgr5蛋白诱导树突状细胞(DC细胞)成熟(Lgr5-CD)。随后使用FACS Calibur/Calibur流式细胞仪检测DC细胞表面标志物DC80、DC83、DC86以及HLA-DR,酶标仪检测DC细胞表面IL-10与IL-12表达量的变化以检测DC细胞成熟情况。然后通过Lgr5-DC诱导产生Lgr5抗原特异性CD8~+的CTL(Lgr5-DC-CD8~+CTL),并通过磁珠分选试剂盒筛选Lgr5-DC-CD8~+CTL。采用FACS Calibur/Calibur流式细胞仪检测Lgr5-DC-CD8~+CTL引起的结肠癌细胞HT29以及正常的人结肠上皮细胞CCD-18C0的凋亡情况,从而验证Lgr5-DC-CD8~+CTL对结肠癌HT29肿瘤细胞的杀伤作用,同时探讨其对人结肠上皮细胞CCD-18C0验证其安全性。同时使用ELISPOT检测分别检测经DC-CD8~+CTL和Lgr5-DC-CD8~+CTL刺激后CCD-18C0与HT29细胞的γ干扰素(IFN-γ)的释放量。建立结肠癌(HT29细胞)裸鼠模型,探究Lgr5-DC-CD8~+CTL对ALB/C-nu/nu(HT29细胞)结肠癌荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用。最后,采用安乐死法(断颈法)处死裸鼠,并立即完整剥取处死裸鼠的皮下肿瘤组织,细胞增殖核抗原(Ki-67)的表达情况采用免疫组化法检测,用以反应结肠癌肿瘤细胞增殖情况。同时,血小板-内皮细胞粘附分子抗体(CD31)及血管内皮生长因子(VEGF),同样采用免疫组化法进行检测肿瘤微血管密度(MVD),用以反应肿瘤微血管生成情况的。此外,通过HE染色,观察经Lgr5-DC-CD8~+CTL治疗后肿瘤组织病理变化。结果:与PBS刺激相比,经Lgr5蛋白刺激后的DC细胞的表面标记物DC 80(42.7±2.8%,为PBS组的3.29倍,P<0.05)、DC 83(44.0±2.8%,为PBS组的3.06倍,P<0.05)、DC 86(45.6±2.9%,为PBS组的2.90倍,P<0.05)和HLA-DR(44.2±3.0%,为PBS组的6.93倍,P<0.05)水平显著上调。ELISA检测结果显示经Lgr5蛋白刺激DC细胞(Lgr5-DC)组的IL-10(231.6±6.7 pg/ml)水平约为经PBS刺激后的DC细胞组(350.2±7.3pg/ml)的0.66倍(P<0.05),而经Lgr5蛋白刺激DC细胞(Lgr5-DC)组的IL-12(373.5±8.9 pg/ml)水平约为经PBS刺激后的DC组(274.6±7.0pg/ml)的1.36倍(P<0.05)。酶联免疫斑点实验(ELISPOT)的检测结果显示:正常结肠上皮细胞CCD-18C0无论与DC-CD8~+CTL共培养后,还是与Lgr5-DC-CD8~+CTL共培养后,其INF-γ的酶联免疫斑点数量均较为相近,分别为(42.3±2.1点/1×10~5个细胞)及(44.1±1.8点/1×10~5个细胞)(P>0.05);而结肠癌细胞HT29与Lgr5-DC-CD8~+CTL共培养后,其INF-γ的酶联免疫斑点数量(182.5±5.2点/1×10~5个细胞)显著高于结肠癌细胞HT29同DC-CD8~+CTL共培养后的的酶联免疫斑点数目(44.0±1.4点/1×10~5个细胞)。同时结肠癌细胞HT29与Lgr5-DC-CD8~+CTL共培养后的INF-γ的酶联免疫斑点数量也同样显著高于CCD-18C0与Lgr5-DC-CD8~+CTL共培养后的INF-γ的斑点数量(44.1±1.8点/1×10~5个细胞)(P<0.05)。经Lgr5蛋白成功刺激DC细胞成熟后,其所诱导产生的特异性细胞毒性T细胞(即Lgr5-DC-CD8~+CTL),与未经过Lgr5蛋白刺激DC细胞成熟所诱导产生的细胞毒性T细胞(即DC-CD8~+CTL)相比,二者引起的正常结肠细胞CCD-18C0的细胞凋亡率相近,分别为11.8±0.8%及12.0±1.0%(P>0.05);由DC-CD8~+CTL诱导结肠癌细胞HT29的凋亡率为12.4±0.9%,而Lgr5-DC-CD8~+CTL则能够显著诱导结肠癌细胞HT29的凋亡,达到了前者的4.40倍,为54.6±1.7%(P<0.05)。Lgr5-DC-CD8~+CTL所诱导的结肠癌HT29细胞的凋亡率(54.6±1.6%)约为其所诱导的正常结肠CCD-18C0细胞凋亡率(11.8±0.8%)的4.63倍(P<0.05)。动物实验研究结果表明,BALB/C-nu/nu裸鼠结肠癌移植瘤经Lgr5-DC-CD8~+CTL治疗后,肿瘤体积增长显著低于PBS组和DC-CD8~+CTL组,依次达到0.25倍和0.24倍(P<0.05)。取得病理组织HE染色后结果显示:经Lgr5-DC-CD8~+CTL处理的肿瘤组织相较其他各组,出现了比较明显的水肿、空泡现象,细胞间隙增大,而肿瘤细胞核则出现了明显的固缩现象。在行结肠癌瘤组织免疫组化探索相关机制的试验中我们观察到,Lgr5-DC-CD8~+CTL组的Ki-67阳性细胞表达数(21.7±7.5%)明显低于DC-CD8~+CTL组(40.6±4.4%,P<0.05)及PBS组(79.6±6.2%,P<0.05);Lgr5-DC-CD8~+CTL组肿瘤组织中CD31阳性的微血管密度(MVD)(2.1±0.3%)明显少于DC-CD8~+CTL组(4.2±0.8%,P<0.05)及PBS组(8.7±0.7%,P<0.05);Lgr5-DC-CD8~+CTL组VEGF阳性率(30.7±4.0%)也明显低于DC-CD8~+CTL组(75.7±3.2%,P<0.01),以及PBS组(80.0±5.0%,P<0.01).以上数据均具有统计学意义。结论:Lgr5蛋白能有效刺激DC细胞成熟,促使其分泌较多具有抗肿瘤作用的IL12及IFN-γ,而抑制具有免疫负性调节作用的IL10。经过Lgr5蛋白刺激而促进成熟的DC细胞(即Lgr5-DC)能够很好地诱导产生Lgr5抗原特异性的CD8~+CTL(即Lgr5-DC-CD8~+CTL).而Lgr5-DC-CD8~+CTL能够很好地抑制并延迟肿瘤组织的生长。进一步探究其机制结果显示其可能与特异性地引起肿瘤细胞调亡、抑制肿瘤细胞增殖及抑制肿瘤组织内微血管生成有关,并从而达到抑制并延迟肿瘤生长的作用,其或许可作为结肠癌免疫治疗的新靶点,并对结肠癌免疫治疗的临床应用可能具有重要意义。
白介素 4 ELISA 试剂盒(IL-4）、Lgr5 抗原 武汉默沙克生物科技有限公司
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