摘要:背景及目的系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)是一种多系统累及的自身免疫性疾病,狼疮肾炎(Lupus Nephritis,LN)则是SLE最常见､最严重的并发症之一,是影响预后的重要因素｡在SLE中约有50-70%的患者在确诊后5年内累及肾脏,5-15%的患者最终在10年内进展为终末期肾脏病｡自从糖皮质激素联合免疫抑制剂应用于LN的治疗以来,缓解率明显增高,但6个月的完全缓解率仍不足10%,3年完全缓解率仅约60%｡由此可见,LN的预后仍不容乐观,加之,SLE主要影响育龄期女性,往往给社会､家庭带来了极大的痛苦与经济负担,因此对LN机制研究并寻找新的靶向治疗非常必要及紧迫｡自噬是在膜包囊泡中通过溶酶体降解胞质内容物的一种生物学过程,主要对受损细胞器和老化蛋白质等大分子物质进行降解,为机体提供合成新的蛋白质和更新细胞器所需的原料,从而维持蛋白代谢平衡及细胞内环境稳定｡自噬异常可导致肿瘤､心血管疾病､肝病以及自身免疫性疾病等｡一些自噬与SLE关系的研究发现,与健康人以及非SLE自身免疫病(血管炎和干燥综合征)患者相比,SLE患者T淋巴细胞自噬水平升高｡自噬基因Atg5缺陷会影响B细胞的发育｡用3-甲基腺嘌呤或渥曼青霉素阻断转染黏蛋白1的树突状细胞内自噬途径,可抑制特异性CD4+T细胞增殖｡目前研究认为,自噬可能通过调节T淋巴细胞､B淋巴细胞以及树突状细胞､巨噬细胞从而在SLE的发病环节中发挥重要作用｡既往自噬与SLE的研究主要集中在免疫细胞,但是当SLE累及肾脏,自噬是否也对肾脏固有细胞存在调控作用?自噬本身是否参与狼疮肾炎的发生发展?目前没有直接的证据,只有一些间接的研究结果可供参考,例如:Hartleben et al.通过敲除小鼠的自噬相关基因Atg5后,小鼠出现了蛋白尿､肾小球硬化以及肾脏足细胞的丢失｡应用从SLE患者血液中分离的ds-DNA抗体刺激足细胞,足细胞的胞质发生抗体聚集现象,并且引发足细胞损伤,自噬抑制剂干预可造成胞内抗体堆积增加,由此表明自噬可能参与了足细胞内抗体的消减以及足细胞损伤的调节｡基于此背景,本课题在细胞学及动物学研究基础上,采用电镜､免疫组化､western blot､qRT-PCR等方法检测狼疮肾炎病程中自噬的表达,评估自噬变化的趋势,进一步探讨自噬被干预后足细胞的生存状态､内质网应激指标及狼疮鼠的尿蛋白情况,从而评估自噬对于疾病的影响,最后通过MyD88-siRNA阻断TLRs/NF-κ B通路后检测自噬及足细胞标志蛋白的表达,揭示自噬激活的通路和调控机制｡方法及结果1.自噬在狼疮肾炎肾组织及足细胞中的表达分析我们应用电镜､qRT-PCR和免疫组化检测,发现狼疮肾炎组肾脏和肾小球足细胞LC3和Beclin1表达高于正常组(P<0.05),同时我们发现反应自噬降解的指标SQSTM1/p62也表达升高｡应用狼疮患者IgG处理足细胞,分别予巴弗洛霉素及Atg5-siRNA干预白噬后,通过western blot､qRT-PCR以及串联RFP-GFP-LC3腺病毒等检测,发现24h､48h及72h不同时间段LC3､Beclin1以及p62的表达均增高,表明自身抗体激活了足细胞的自噬,但激活的自噬存在降解障碍｡2.自噬在狼疮肾炎足细胞损伤中的作用分析应用LNIgG孵育足细胞,雷帕霉素及Atg5-siRNA干预自噬后,western blot检测发现狼疮IgG诱导足细胞标志物Nephrin､CD2AP表达下降;较之LNIgG组,沉默自噬基因Atg5引起Nephrin和CD2AP的表达减低明显;与之相反,雷帕霉素干预后Nephrin､CD2AP表达较LNIgG组增加｡流式分析表明,Atg5-siRNA促进足细胞的凋亡,然而,雷帕霉素减轻了足细胞凋亡的发生｡动物学研究再次证明雷帕霉素处理狼疮小鼠后尿蛋白量明显减少,Atg5-siRNA干预后尿蛋白量明显加重,western blot检测发现,对比狼疮组,雷帕霉素+LN组肾脏Nephrin､CD2AP表达增高,内质网应激蛋白指标GRP94表达减低,Atg5-siRNA+LN组Nephrin､CD2AP表达减低,GRP94表达增高｡由此推测,自噬可以保护足细胞并抑制狼疮肾炎病情进展｡3.狼疮肾炎中激活自噬的NF-K B通路分析狼疮IgG处理足细胞后,经western blot检测发现,Atg5-siRNA干预导致MyD88及nucleus NF-κB p65的表达增加,故自噬可以抑制狼疮肾炎NF-κB通路相关炎症反应｡随后western blot检测到,与LN组相比,MyD88-siRNA干预后的足细胞Nephr in和CD2AP表达增加,说明阻断MyD88可以减轻抗体诱导的足细胞损伤｡最后,我们发现在抗体诱导的足细胞损伤中,MyD88阻断后足细胞自噬表达减低,说明自噬可能通过TLRs/NF-κ B通路介导激活,并负反馈抑制TLRs/NF-κ B相关炎症反应｡结论狼疮肾炎肾脏组织中存在自噬的增强,狼疮IgG诱导足细胞的异常自噬增强,也造成了足细胞的损伤;通过干预自噬后评估足细胞生存状态及狼疮小鼠的病情变化,我们发现自噬发挥保护足细胞和肾脏的作用｡狼疮抗体诱导足细胞内质网应激,自噬可以抑制细胞中过高的内质网应激反应来保护足细胞｡在抗体诱导的足细胞损伤中,自噬可能通过MyD88介导的TLRs/NF-κ B通路而被激活,从而负性调控TLRs/NF-κ B相关的炎症反应来保护足细胞｡自噬的调控可能是未来治疗狼疮肾炎的有效手段,也是预防狼疮肾炎发生的有效措施｡
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