背景：

急性肺损伤（ALI）是一种严重的临床综合征，其特征是由各种肺部疾病过程引起的肺水肿和炎症，通常需要机械通气和皮质类固醇治疗。尽管ALI 的治疗方法取得了很大的进步，但其死亡率依然较高，易发展为急性呼吸窘迫综合征。到目前为止，ALI 的有效治疗方法依然相对有限。努力发现新的治疗药物，阻断ALI 的进展一直是医学研究的热点及难点。连翘脂素是中药连翘的活性成分之一，属于木脂素类成分，目前已被纳入中药连翘的指纹成分。近年来研究发现连翘脂素具有良好的抗炎活性，不断有学者通过RAW264.7 细胞、BEAS-2B 细胞、L02 细胞等体外细胞实验进行验证，且其抗炎作用可能是通过多靶点和多途径实现的。但是，连翘脂素对体内抗炎活性研究方面的报道还相对比较缺乏。关于连翘脂素对ALI 的保护作用也鲜见报道。因此，本课题拟从整体动物、组织器官和细胞分子水平，并采用网络药理学和分子对接等现代研究手段，对连翘脂素的抗炎作用和抗ALI 机理进行深入研究。在进行抗ALI 作用研究之前，本课题首先对连翘脂素的药理活性从毒理、量效关系、副作用、镇痛、抗炎机制等方面进行一个比较系统的研究，然后聚焦到具体的急性炎症模型----急性肺损伤上来进一步阐明连翘脂素的活性，以期为连翘脂素的体内研究和临床应用提供开发应用依据。

研究方法：

（1）连翘脂素的急性毒性实验研究：采用最大给药量法，小鼠单次口服灌胃连翘脂素5 g/kg，观察小鼠出现的反应。

（2）评价连翘脂素的抗炎镇痛作用，并观察连翘脂素的不良反应：以二甲苯致小鼠耳肿胀和λ-角叉菜胶致小鼠足肿胀两种动物模型进行连翘脂素抗炎作用研究。采用扭体法、热板法、甩尾法三种小鼠模型考察连翘脂素的镇痛作用。同时考察连翘脂素对正常小鼠体温的影响，排除其不良反应。初步观察连翘脂素对凝血系统的影响，通过剪尾法和毛细血管法考察连翘脂素对体内出血和凝血时间的影响，检测小鼠凝血四项并取人正常血浆测定体外凝血四项。

（3）连翘脂素对LPS 联合人正常血浆诱导的A549 细胞炎症损伤的作用及机制研究：通过 LPS 联合人正常血浆（NHP）诱导A549 细胞建立体外炎症损伤模型。通过ELISA 和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测细胞中炎症介质的变化观察连翘脂素对细胞炎症损伤的保护作用。基于网络药理学预测连翘抗ALI 关键靶标和信号通路，并与连翘脂素进行分子对接；运用免疫荧光、qRT-PCR 和Western blot 检测连翘脂素作用后以上关键基因和蛋白的表达情况。

（4）连翘脂素对LPS 诱导的小鼠ALI 的作用及机制研究：将小鼠分为空白、模型、阳性药地塞米松组、连翘脂素25 和12.5 mg/kg 组。HE 染色观察肺组织病理变化；计支气管肺泡灌洗液（BALF）白细胞数目和蛋白浓度，并通过流式细胞仪检测巨噬细胞和中性粒细胞数量；ELISA 和qRT-PCR 检测炎症介质的蛋白和基因表达变化；并采用免疫组化、免疫荧光、qRT-PCR、Western blot 和透射电镜对关键通路的基因和蛋白进行体内实验验证。

研究结果：

（1）连翘脂素5 g/kg 灌胃给药后未出现小鼠死亡，未见明显毒性反应。连翘脂素灌胃给药后对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀、角叉菜胶所致足肿胀显示出良好的对抗作用；对小鼠足肿胀组织白细胞增多具有抑制效应，并抑制NF-κB 通路的激活；镇痛实验结果显示，连翘脂素可显著减少小鼠扭体次数并延长小鼠疼痛潜伏期和痛阈值；连续给予不同剂量的连翘脂素（6.25、12.5、25 mg/kg）后，不同时间点小鼠肛温无明显变化；连翘脂素6.25-100 mg/kg 范围内小鼠体内出血时间、凝血时间和体内外凝血四项均无显著变化。

（2）连翘脂素对LPS 联合人正常血浆诱导的A549 细胞炎症损伤模型的保护作用及机制研究：A549 细胞受1 μg/mL LPS 联合5%NHP 刺激后，未见细胞活力明显下降及凋亡现象，炎症介质含量显著增加，核内NF-κB p65 荧光强度显著增加，模型成立；连翘脂素干预细胞后可以降低细胞中炎症因子、趋化因子和黏附分子的表达；网络药理学和分子对接结果显示连翘脂素可能通过作用于凋亡、MAPK、NF-κB、补体级联系统、JAK-STAT 信号通路改善ALI；体外细胞验证实验结果表明，连翘脂素可以显著降低补体C3、C5a 和C5aR1（CD88）的表达，p65 核内荧光强度及NF-κB信号通路相关基因和蛋白的表达，p38、JNK 和EKR 的磷酸化水平及JAK2/STAT3的基因和蛋白表达。

（3）连翘脂素对LPS 诱导的小鼠ALI 的保护作用及机制研究结果显示，连翘脂素可以显著降低BALF 中蛋白含量和白细胞数目，改善肺组织病理病变，降低肺组织、BALF 和血清中炎症介质的表达；qRT-PCR 结果表明连翘脂素可以降低肺组织中补体成分C3、C6、fB 和补体受体CD88 表达；免疫组化和免疫荧光结果显示连翘脂素下调补体C3、C5b-9 和C5a、CD88 蛋白表达；qRT-PCR、免疫组化和Western blot 结果显示连翘脂素可以改善TLR4-MyD88-IKKβ-IκBα-p65 的表达，降低p65 磷酸化水平；抑制MAPK、JAK2/STAT3 及线粒体凋亡相关基因和蛋白的表达；透射电镜结果显示连翘脂素明显减轻肺组织线粒体损伤。

结论：

连翘脂素具有良好的抗炎和镇痛作用，连翘脂素能够通过减轻LPS 诱导的肺上皮细胞损伤，抑制肺组织炎症反应，减少中性粒细胞浸润及炎症介质表达来实现对LPS 致急性肺损伤小鼠的保护作用，其作用机理与抑制LPS-C5a-C5aR1 和LPS/TLR4信号通路进而抑制NF-κB、MAPK 和JAK2-STAT3 信号传导通路的活化密切相关。

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