研究目的

在中医理论指导下， 研究活血降糖饮对２ 型糖尿病模型大鼠的糖脂代谢、胰岛素抵抗和肠道菌群稳态的调控作用及具体机制； 通过对活血降糖饮主要活性化学成分的检测分析， 并进一步探讨其对２ 型糖尿病大鼠的糖脂代谢和胰岛素抵抗的影响； 此外，通过“HPLC-MS”及药效验证” 建立活血降糖饮（ 冻干粉） 质量控制标准以确保多次研究结果的可重复性。

材料和方法

本研究主要包括活血降糖饮对２ 型糖尿病大鼠的糖脂代谢、胰岛素抵抗和肠道菌群稳态的作用及其机制研究和活血降糖饮质量控制标准研究。

１ 、SPF级雄性的Wistar大鼠52只，7周龄，体重150±20ｇ，适应性喂养7天后，按照体重随机分为正常组和造模组，正常组大鼠10只，其余造模组， 正常组大鼠给予普通标准饲料喂养，造模组给予高脂饲料（D12492，60％脂肪）喂养。在４周末禁食不禁水１２小时后给予造模组大鼠腹腔注射２％链脲佐菌素（streptozocin，STZ）（35ｍg/kg）（溶解于PＨ＝4.4的无菌柠檬酸钠缓冲液），正常组大鼠注射等体积的0.1mol/L柠檬酸缓冲液。分别在注射STZ3d、7d 、14d采用血糖仪测定大鼠的空腹血糖（大鼠禁食１２小时）。造模组大鼠空腹血糖在11.1--33.3 ｍmol／Ｌ之间， 且在14d后相对稳定的大鼠被认为造模成功，纳入研究；将造模组大鼠按体重和空腹血糖随机分为５组（ｎ＝10）：模型对照组（Ｍｏｄ）、二甲双胍组（Ｍet）、活血降糖饮低剂量组（HXJTL）、活血降糖饮高剂量组（HXJTL）。另设正常对照组（Norn＝10只）。正常和模型对照组的大鼠给予双蒸水灌胃， 剂量为５ml／kg b.ｗ；二甲双狐组大鼠给予二甲双胍（90mg／kg）；活血降糖饮低剂量组给予活血降糖饮冻干粉1.25ｇ／kg，活血降糖饮高剂量组给予活血降糖饮冻干粉５g／kg。每日灌胃给药一次， 连续给药8周。

２ 、每日观察记录大鼠的状态和更换垫料， 每周记录大鼠体重一次， 每３ 天记录一次摄水摄食量。每周釆用经割尾法采集大鼠尾部静脉血， 用罗氏血糖仪测量空腹血糖（ 禁食１ ２ 小时） 并记录； 在给药８ 周末， 所有大鼠禁食不禁水１ ２ 小时后， 进行口服糖耐量试验（ OGTT ） ， 给予2g／kg 葡萄糖溶液灌胃，分别在0、30 、60、120分用血糖仪用血糖仪测尾静脉血糖。

３ 、分别在给Ｓ ＴＺ 造模前时间点（-4w ）、STZ 造模后给药干预治疗前（0w） 、给药治疗８ 周结束前（8w） 采集大鼠肠道粪便， 釆用TIANamp Stool DNA  kit 试剂盒提取肠道粪便中的肠道菌群基因组DNA，使用Illumina Miseq 基因测序平台对肠道粪便中所有微生物的16s rRNA 的V4区域进行DNA测序， 并进行相关分析肠道菌群物种的丰度和多样性。

４ 、药物干预结束后， 采集大鼠血液和摘取大鼠胰腺、肝脏、骨骼肌、肾脏等组织； 酶标法检测大鼠的血脂谱（TG、TC 、LDL-ｃ、HDL- c） 水平、血清肌酐、尿素氮、SOD 、MDA ， 以及糖原合成酶、己糖激酶等活性酶水平；ELISA 发检测大鼠的空腹胰岛素、血清瘦素、脂联素、TNF-α 等； 采用蒽酮法检测肝脏的肝糖原、骨骼肌的肌糖原、血清游离脂肪酸等； Ｈ Ｅ 染色和免疫组化染色检测胰腺组织的病理变化； TUNEL法检测胰腺组织胰岛细胞的凋亡； Western blot 法检测肝脏组织Ｐ-ACC 、Ｐ-AKT蛋白和骨骼肌PI3K 、AKT、Ｐ-ACC 、GLUT4 蛋白的表达。Western blot法检测胰腺组织相关凋亡蛋白。

５ 、通过ＨPLC-ＭS方法测定活血降糖饮中主要活性成分， 将含量最高的两个活性成分（ 梓醇和羟基红花黄色素Ａ）也通过对2型糖尿病大鼠进行验证实验， 具体方法同前。

６ 、此外， 采用2015年版的《中药药典》规定作为中药成分质量检测标准， 以HPLC法检测不同加工提取工艺制备的活血降糖饮药液成分， 优化活血降糖的提取工艺。在优化加工工艺的基础上， 通过中药成分数据库挖掘出活血降糖饮中所具有的已知活性成分， 然后结合现有数据库中存在的最可能具有代谢调控作用的主要活性成分， 筛选出22种主要活性成分； 采用HPLC-MS 的方法对这22个主要活性成分进行检测作质量控制， 并将这一标准制备成的活血降糖饮（ 冻干粉） 在T2DM 模型大鼠上进行药效预验证， 最后将这一验证显效的中药复方一系列制备工艺标准作为活血降糖饮研究用药的质量控制标准。

研究结果

１ 、高脂饲料喂养4周加小剂量（35 mg／kg）— 次性腹腔注射建立的２型糖尿病大鼠与人类２型糖尿病类似， 都存在明显的胰岛素抵抗、多饮多尿和血脂代谢紊乱等；造模成功率超过90％ ， 且模型组的大鼠全程空腹血糖趋于平稳； 活血降糖饮可以显著降低２ 型糖尿病大鼠的能量和水的摄入， 尽管没有对体重产生过大的影响； 在干预８周后， 低剂量和高剂量的活血降糖饮组的空腹血糖分别下降54.83％和56.16％ ， 显著高于模型组（Ｐ＜0.0５ ） ； 给药组的OGTT 曲线下面积也显著低于模型组（Ｐ<0.01） ，但是高剂量组没有明显优于低剂量组。

２ 、在给药治疗８ 周后， 活血降糖饮给药组的大鼠胰岛素抵抗指数和胰岛ｐ 细胞功能均得到明显改善（Ｐ＜0.05 或P＜0.01）；与模型组比较， 活血降糖饮组的血脂水平（TG 、TC、LDL-ｃ）均有显著下降（ P＜0.05） ， 血清肌酐水平也有明显下降（ Ｐ＜0.01）， 而对HDL-c、AST、ALT、BUN等没有明显影响。

３ 、活血降糖饮能改善T2DM大鼠的氧化应激和炎症状态， 与模型组比较， 活血降糖饮组的血清SOD活性水平明显提高，MDA水平、TNF-α 游离脂肪酸水平等显著下降（ Ｐ＜0.05 ） 。活血降糖饮可以改善T2DM大鼠的瘦素抵抗， 血清瘦素水平显著下降， 脂联素明显上升（ Ｐ<0.05）； 同时， 与模型组比较， 活血降糖饮还可以升高肝糖原、肌糖原、糖原合成酶和己糖激酶等的含量（ Ｐ＜0.05 ） 。

４ 、HE染色、免疫组化染色和TUNEL 法凋亡检测结果显示， 活血降糖饮对胰腺具有较好的保护作用。它能维持骄傲的β细胞形态， 增加胰岛细胞数量， 上调insulin的表达， 抑制β细胞凋亡等；Western blot结果显示， 活血降糖饮能上调肝脏和骨骼肌组织的P-ACC、AKT（ P-akt） 蛋白表达（ Ｐ<0.05） ， 上调骨骼肌PI3K 和GLUT４蛋白的表达（ Ｐ<0.05 ） 此外， 与模型组比较， 经过活血降糖饮或二甲双胍治疗后， 胰腺组织的促凋亡蛋白BAX 、Caspase-3表达下调（P＜0.00１ ）， 而抑凋亡蛋白BCL-2的表达则明显上调（P＜0.00ｌ ） 。

５ 、肠道菌群基因组测序结果显示， 与正常对照组比较， 模型组的大鼠肠道菌群丰度和多样性降低， 致病菌种类和数目增加， 表现为明显的肠道稳态失衡； 活血降糖饮可以显著增加Lactobacillaceae、Lachnospiraceae等有益菌的种类和数目， 而降低如Prevotellaceae和Porphyromon adaceae等致病菌种类； 相关性分析显示， 活血降糖饮调控的肠道菌群与空腹血糖、血脂和胰岛素抵抗显著相关，KEGG分析也显示， 这些被调控的肠道菌群主要涉及的是糖脂代谢通路。

６ 、活血降糖饮中两个主要活性成分也具有明显改善２2型糖尿的大鼠的糖脂代谢作用， 与模型组比较， 梓醇和羟基红花黄色素Ａ 均可以明显降低T2DM大鼠的空腹血糖、血脂水平和胰岛素抵抗指数（P＜0.05） 。

７ 、此外， 优化了活血降糖饮药液的提取制备工艺， 通过数据库和文献检索筛选出活血降糖饮可能具有代谢性调控作用的22个主要活性成分， 制备的活血降糖饮冻干粉具有对2型糖尿病大鼠糖脂代谢调节作用， 该制备加工工艺和质量控制标准可以作为活血降糖饮质量控制标准， 可以确保研究结果的可重复性。

结论：

１ 、通过HFD喂养加STZ注射的方法可以建立与人类疾病相似且稳定的T2DM大鼠模型； 活血降糖饮能够明显改善T2DM大鼠的摄食摄水及多饮多尿症状， 降低空腹血糖和血脂水平， 改善胰岛素和瘦素抵抗； 同时， 还可以改善内毒素血症所致的症和氧化应激状态， 维持胰岛细胞形态， 抑制胰岛β细胞凋亡， 并促进胰岛素的分泌。

２ 、活血降糖饮治疗Ｔ ２ Ｄ Ｍ 的潜在机制可能是升高肝糖原、肌糖原、糖原合酶和己糖激酶的含量， 改善炎症和氧化应激状态， 改善胰岛素抵抗与PI3K／AKT 信号通路和提高骨骼肌GLUT4 表达， 调控胰腺组织相关凋亡蛋白（BAX、Caspase-3和BCL-2） 。

３ 、通过HFD喂养加STZ注射的方法建立的T2DM大鼠模型的肠道菌群稳态明显失衡， 活血降糖饮可以显著改善Ｔ２ Ｄ Ｍ 大鼠的肠道菌群紊乱状态， 主要表现在减少了如Prevotellaceae等致病菌的数量， 增加如乳酸杆菌（Lactobacillaceae） 等有益菌的数量， 整体调节肠道菌群构成； 药物菌群Marker与糖脂代谢的生化指标等疾病特征呈负相关， 这些有益杆菌与丁酸盐产生密切相关， 其可能是通过提高的SCFAs等代谢产物， 可能参与T2DM糖脂代谢和胰岛素抵抗相关信号通路的调控作用来发挥T2DM的治疗作用.

４ 、活血降糖饮主要有效活性成分梓醇和羟基红花黄色素Ａ ，T2DM 大鼠干预实验也证实均具有明显改善糖脂代谢和胰岛素抵抗的作用； 但是中药活性单体的作用是否与复方一样在人体身上取得类似的治疗效果仍有待进一步的研究。同时， 这也为中药复方的整体和拆方研究提供了一个思路。

５ 、通过对活血降糖饮主要的活性成分控制来建立活血降糖饮的质量控制标准是可行的， 通过不同的实验验证结果显示几乎一致的药效作用。这也为中药复方的可重复研究思路提供了很好的借鉴。

大鼠胰岛素酶联免疫试剂盒，小鼠胰岛素酶联免疫试剂盒，大鼠糖原合成酶(GS)试剂盒，大鼠脂联素(APN) 试剂盒，大鼠肿瘤坏死因子（TNF-α） 试剂盒，瘦素（LEP）检测试剂盒，胰高血糖素检测试剂盒，总胆汁酸检测试剂盒                                                                武汉默沙克生物科技有限公司