背景:副溶血弧菌是海产品相关性食物中毒的首要病原菌,能表达多种毒力因子并具有很强的生物膜形成能力。QsvR是Ara C家族转录调控子,对副溶血弧菌毒力、生物膜形成、运动性等都具有调控作用。环二鸟苷酸(cyclic diguanosine monophosphate,c-di-GMP)是普遍存在于细菌中的一种第二信使,对生物膜形成、毒力、运动性等均有调控作用。QsvR对副溶血弧菌中c-di-GMP代谢的调控机制也需要进一步研究。目的:利用比较转录组学(RNA-seq)方法探究QsvR的调控元,并进一步研究QsvR调控c-di-GMP代谢的分子机制。方法:采用生物膜结晶紫染色实验分析QsvR对副溶血弧菌生物膜形成的调控作用。采用RNA-seq分析生物膜形成条件下WT和qsvR突变株(ΔqsvR)的差异表达基因;利用实时定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,qPCR)实验、lux报告基因融合实验、凝胶阻滞实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)验证RNA-seq结果并分析QsvR对c-di-GMP代谢相关基因的调控关系;构建若干与c-di-GMP代谢相关的基因突变株,利用透明度实验、结晶紫染色实验、cdi-GMP浓度测定、swimming和swarming表型实验初步探究c-di-GMP代谢相关基因的功能。结果:生长曲线测定结果表明WT和ΔqsvR在不同培养条件下的生长趋势一致,表明QsvR不影响副溶血弧菌生长。生物膜结晶紫染色实验结果显示,不同培养时间(24 h和48 h)下,ΔqsvR的生物膜形成量均高于WT的,表明QsvR抑制生物膜的形成。RNA-seq结果表明,相较于野生株,ΔqsvR中共存在1735个差异表达基因,其中880个基因表达上调,855个基因表达下调;GO富集共注释到三个一级分类,包括30个富集最显著的二级分类;1735个差异表达基因被归类至6类KEGG通路;1483个差异表达基因被注释到21个COG功能分类;差异表达基因中包含:16个胞外多糖合成相关基因(14个上调、2个下调)、19个荚膜多糖合成相关基因(均下调)、15个Ⅳ型菌毛相关基因(均下调)、35个极鞭毛合成相关基因(除flg A外,其余均下调)、16个侧鞭毛合成相关基因(7个下调、9个上调)以及24个c-di-GMP代谢相关基因(11个下调、13个上调)。qPCR和lux报告基因基因融合实验证实了RNA-seq结果的可靠性。c-di-GMP浓度测定显示,不同的培养时间(24h和48h)下,ΔqsvR中的c-di-GMP浓度均低于WT中的,表明QsvR促进副溶血弧菌中c-di-GMP的合成;EMSA实验结果显示QsvR可直接结合到19个c-di-GMP代谢相关基因的上游启动子区而直接调控这些基因的转录。此外,VP0117、VPA0198和VP2979均是推定的和c-diGMP代谢有关的基因,因此本研究构建了vp0117突变株(Δvp0117)、VP0117的EAL结构域突变株(Δvp0117-EAL)、VP0117的GGDEF结构域突变株(Δvp0117-GGDEF)、vpa0198突变株(Δvpa0198)和vp2979突变株(Δvp2979),进而分析它们对生物膜相关表型的影响。结果显示,Δvp0117和Δvp0117-EAL的生物膜形成量均高于WT的,表明VP0117抑制生物膜的形成;c-di-GMP浓度测定表明VP0117抑制副溶血弧菌细胞内c-di-GMP的合成;Δvp0117、Δvp0117-EAL及Δvp0117-GGDEF的爬动能力与WT的相当,而Δvp0117和Δvp0117-EAL泳动能力受到抑制;透明度实验表明VP0117不影响副溶血弧菌荚膜多糖的产生。相比之下,VP2979和VPA0198不影响副溶血弧菌的c-di-GMP合成、荚膜多糖合成以及生物膜形成,但二者均抑制爬动能力;此外VP2979抑制泳动能力。结论:QsvR是副溶血弧菌的一个全局调控子,控制大量基因的表达,这些基因涉及众多细胞通路。在生物膜形成条件下,QsvR直接调控许多c-di-GMP代谢相关基因的转录,从而并促进c-di-GMP的合成。

微生物环二鸟苷酸（c-di-GMP）ELISA 试剂盒                 武汉默沙克生物科技有限公司