背景:副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)形成成熟的生物膜需要一些特定的结构,包括胞外多糖、IV型菌毛和荚膜多糖,并受到密度感应和环二鸟苷酸(cdi-GMP)等各种调控通路的严格调控。Qsv R是一种Ara C型调控子,通过直接调控密度感应系统核心调控子Aph A和Opa R的转录整合到密度感应系统调控级联中。在野生型或opa R突变背景下,qsv R的缺失改变了副溶血弧菌生物膜的形成能力,提示Qsv R可能与Opa R协同控制生物膜的形成。目的:探究Qsv R和Opa R对副溶血弧菌生物膜形成的联合调控作用方法:采用生物膜结晶紫染色和菌落褶皱实验来探究Qsv R和Opa R对生物膜形成的调控是否具有相互作用;采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验测定菌体的胞内c-di-GMP浓度,分析Qsv R和Opa R对副溶血弧菌c-di-GMP合成的共同调控作用;通过透明度实验来探究Qsv R和Opa R对副溶血弧菌菌落透明度变化的共同调控作用。选取胞外多糖相关基因cps A和scv E、Ⅳ型菌毛相关基因pli A和msh B、c-di-GMP代谢相关基因scr A和scr G、荚膜多糖相关基因VP0218和VP0219作为靶基因,运用q PCR和Lac Z报告基因融合实验来分析Qsv R和Opa R对靶基因转录的调控关系;运用双质粒报告基因实验和EMSA来探究Qsv R和Opa R在大肠杆菌及体外条件下对靶基因转录是否具有直接的调控作用。结果:生物膜结晶紫染色和菌落褶皱实验显示Δqsv R/p BAD33、Δopa R/p BAD33和Δqsv RΔopa R/p BAD33形成更多的生物膜,产生更褶皱的菌落形态,并且Δqsv R/p BAD33-opa R和Δopa R/p BAD33-qsv R能够回补Δqsv R/p BAD33和Δopa R/p BAD33的生物膜产生量以及褶皱的菌落形态,表明Qsv R和Opa R共同抑制副溶血弧菌的生物膜形成,并且二者具有相互回补的作用。酶联免疫吸附实验显示Δqsv R/p BAD33、Δopa R/p BAD33和Δqsv RΔopa R/p BAD33产生更多的c-diGMP,并且Δqsv R/p BAD33-opa R和Δopa R/p BAD33-qsv R的c-di-GMP产生量可以恢复到WT/p BAD33水平,表明Qsv R和Opa R共同抑制胞内c-di-GMP的合成,并且二者具有相互回补的作用。透明度实验显示Δqsv R/p BAD33、Δopa R/p BAD33和Δqsv RΔopa R/p BAD33菌株产生透明的菌落,而WT/p BAD33、C-Δqsv R、Δqsv R/p BAD33-opa R、C-Δopa R和Δopa R/p BAD33-qsv R的菌落为不透明状态,表明Qsv R和Opa R共同调控菌落透明度从不透明到透明之间的转化;分子实验表明Opa R直接抑制cps A和scv E的转录,而Qsv R对它们的转录没有调控作用;Qsv R和Opa R均能够直接促进msh A1、pil A、scr G、VP0218和VP0219的转录,并且二者具有互补作用。Opa R直接而Qsv R间接抑制scr A的转录。竞争性EMSA实验表明,His-Qsv R和His-Opa R与靶基因启动子区DNA的结合不具有竞争作用。总之,Qsv R和Opa R协同抑制生物膜相关表型和c-di-GMP代谢,促进副溶血弧菌形成不透明菌落。Qsv R能够恢复opa R突变引起的生物膜相关表型变化,反之亦然。Qsv R和Opa R协同调控胞外多糖生成相关基因、IV型菌毛相关基因、荚膜多糖合成相关基因以及c-di-GMP代谢相关基因的转录。结论:Qsv R和Opa R协同抑制副溶血弧菌的生物膜形成能力,二者可以相互弥补基因突变后的表型缺陷,但没有叠加效应;Qsv R和Opa R通过直接调控生物膜形成相关基因的转录来调控生物膜形成。 

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